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   Purificación de Ácidos Nucleicos

   

Métodos caseros 

Hay que tener en cuenta una serie de consideraciones generales:

Tipo y volumen/cantidad de muestra a utilizar. En el caso de que la muestra sea sanguínea, hay que elegir si usar plasma, suero, sangre total o fracción leucocitaria. En caso de que se use plasma también hay que decidir que tipo de coagulantes usar (EDTA, heparina o citrato), ya que el anticoagulante usado puede afectar mucho a la capacidad del ensayo para detectar la secuencia diana. Cantidades mínimas de sangre total inhiben una PCR típica. Se puede añadir transferrina bovina junto con su cofactor para evitar la inhibición que provoca el grupo hemo de la sangre sobre la Taq polimerasa, ya que esta proteína se une a este grupo hemo, impidiendo que éste inhiba a la polimerasa.

Deben ser determinados empíricamente.

No existe un protocolo universal para todos los tipos de muestras

El método ideal representa un equilibrio entre los requerimientos de la muestra y los del ácido nucleico diana.

Hay que tener en cuenta que los reactivos que tradicionalmente se emplean en alguna etapa del proceso de extracción pueden interferir en los posteriores pasos de la técnica que vamos a utilizar:

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Tampón Tris-EDTA (TE): es un inhibidor de nucleasas y un buen tampón para la conservación del ADN. El EDTA inhibe la PCR a concentraciones superiores a 1mM.

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Fenol: desnaturaliza las proteínas contaminantes de la muestra. Se usa para eliminar la proteínas (proteasas, nucleasas...); disminuye el rendimiento de la PCR a concentraciones del 0,2% y al 0,5% la inhibe completamente.

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Cloroformo: permite la separación de 2 fases; el ADN queda en la fase acuosa y en la fase orgánica quedan las proteínas y otros contaminantes.

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Etanol e isopropanol: precipitan los ácidos nucleicos. Tienen efectos inhibitorios a concentraciones superiores al 1%

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Isotiocianato de guanidinio: es un agente caotrópico (favorece la disolución en agua de compuestos insolubles) que inhibe las RNasas y conserva el ARN

 
El SDS es un detergente iónico que desnaturaliza las proteínas pero también inhibe la PCR a concentraciones mínimas.
Otras sustancias que presentan efectos inhibitorios sobre la PCR son el cloruro sódico, la hemoglobina, la heparina o la urea.

Todos los protocolos suelen incluir un paso de lisis con 0,2-1% de SDS, seguido de extracción con fenol, y la precipitación con etanol en presencia de acetato sódico. Por lo tanto, todos estos contaminantes deben ser eliminados antes de comenzar con la técnica de Biología Molecular propiamente dicha.

Los pasos generales del proceso de extracción son:

Lisis: rotura de los tejidos y liberación de los ácidos nucleicos.

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Puede ser un paso muy sencillo en el caso de los virus y algunas bacterias, pero muy difícil en el caso de otras bacterias, hongos o determinados tejidos (como plantas).

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Generalmente se usan tampones que contienen detergentes para romper la membrana celular y proteasas para digerir las proteínas celulares.

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La proteinasa K, es la proteasa más usada por ser la de más amplio espectro (degrada todas las proteínas), se conoce bien su funcionamiento y está muy estudiada y se suele usar con tampones que contienen SDS y EDTA.

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El proceso de lisis se puede realizar mediante métodos físicos o químicos:

ebullición en agua destilada o tampón de PCR

uso de detergentes con o sin calor
uso de hidróxido sódico con calor
ciclos de congelación-descongelación
SDS-proteinasa K
sonicación
nitrógeno líquido
uso de enzimas como la lisozima

Protección y estabilización de los ácidos nucleicos frente a la degradación (el ARN es más difícil de estabilizar que el ADN)

Eliminación de proteínas e inhibidores de la amplificación

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Para algunas muestras (como esputo o sangre) este proceso requiere más pasos que para otras (como orina o LCR)

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Un método rápido, pero no muy limpio es el denominado "salting-out", en el que se precipitan las proteínas y otros contaminantes con elevadas concentraciones de sales (como el acetato amónico) quedando el ADN en disolución.

Concentración de la muestra en un pequeño volumen
Colocación del ácido nucleico en un medio acuoso compatible con el método de amplificación

El método de purificación de ADN genómico más ampliamente utilizado es el del fenol cloroformo, que consta de los siguientes pasos:

1.

Añadir un volumen igual al de la muestra de la mezcla fenol/cloroformo/alcohol isoamílico (25:24:1) y agitar con vórtex.

2.

Centrifugar a temperatura ambiente y transferir la parte acuosa que contiene el ácido nucleico a otro tubo

3.

Añadir acetato sódico para facilitar la precipitación con etanol, y después añadir etanol al 100% frío.

4. Dejar precipitar a –20°C durante 30 minutos
5. Centrifugar y eliminar el sobrenadante
6. Lavar con etanol al 70%, para re-precipitar
7. Centrifugar y eliminar el sobrenadante de nuevo
8. Resuspender en tampón TE


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